Membrane proteins are an interesting class due to the variety of cellular functions and their importance as pharmaceutical targets, but they pose significant challenges for fragment-based drug... Show moreMembrane proteins are an interesting class due to the variety of cellular functions and their importance as pharmaceutical targets, but they pose significant challenges for fragment-based drug discovery approaches. Here we present the first successful use of biophysical methods to screen for fragment ligands to an integral membrane protein. Using the recently developed Target Immobilized NMR Screening (TINS) approach, we screened 1,200 fragments for binding to the enzyme Disulphide bond forming protein B. Biochemical and biophysical validation of the 8 most potent hits revealed an IC50 range of 7 to 200 uM, which could be categorized as cofactor binding inhibitors or mixed model inhibitors of both cofactor and substrate protein interaction. Our results establish the utility of fragment-based methods in the development of inhibitors of membrane proteins, making a wide variety3of important membrane bound pharmaceutical targets amenable to such an approach. We first tested the immobilization procedure on G protein coupled receptors and ion channels. Furthermore, we used Nanodiscs, an alternative solubilization strategy, to solubilize teh protein without detergents. This resulted in less broad NMR signals, less non-specific binding issues, and identification of the binders from the original screen, proving that the nanodisc solubilization technique is compatible with TINS. Show less
Nucleosome Dynamics Resolved with Single-Pair Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy Het oprollen van DNA in een nucleosoom is de eerste stap van DNA condensatie in de eukariotische... Show moreNucleosome Dynamics Resolved with Single-Pair Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy Het oprollen van DNA in een nucleosoom is de eerste stap van DNA condensatie in de eukariotische celkern. Nucleosomen vormen obstakels voor enzymen die het opgevouwen DNA binden, en spelen om die reden een belangrijke rol in genregulatie. Om te begrijpen hoe de toegankelijkheid van nucleosomaal DNA wordt gecontroleerd, is het noodzakelijk om de moleculaire mechanismen te ontrafelen die hieraan ten grondslag liggen. Dit proefschrift doet verslag van een experimentele studie met behulp van enkel-paar Fluorescentie Resonantie Energie Overdracht Spectroscopie (single-pair Fluorescence Resonance Energy Transfer, ofwel spFRET). De technieken die we hebben ontwikkeld zijn met name geschikt om de dynamica te bestuderen van heterogene DNA-eiwitcomplexen. Met behulp van spFRET was het mogelijk om de structuur van het DNA in __n enkel nucleosoom te volgen in de tijd. Daarmee laten we zien dat nucleosomaal DNA spontaan loskomt van de histon kern. Doordat dit frequent gebeurt, is het DN A in nucleosomen toegankelijk voor enzymen op biologische relevante tijdschalen. Show less
