Around the clock: exploring circadian targets using chemical tools and small-molecule modulators

Abstract

Het circadiane ritme is een belangrijk biologisch proces dat essentiële moleculaire en fysiologische processen reguleert. Ondanks dat het nauwkeurig wordt gereguleerd door transcriptie-translatie feedbacklussen (TTFL’s) van de belangrijkste klok genen, kan het ritme verstoord raken. Dergelijke verstoringen worden in verband gebracht met een breed scala aan gezondheidsproblemen. Hoewel er vooruitgang is geboekt in het begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de circadiane regulatie en het therapeutisch potentieel van het richten op gerelateerde signaalcascades, blijft het aantal farmacologische hulpmiddelen om de circadiane klok te bestuderen beperkt. In dit proefschrift zijn nieuwe chemische hulpmiddelen en kleine moleculen ontwikkeld en gekarakteriseerd die gericht zijn op klokgerelateerde signaalcascades. Deze zijn geëvalueerd in biochemische en cellulaire assays om hun potentieel voor het bestuderen van circadiane regulatie te beoordelen.

In Hoofdstuk 1 van dit proefschrift wordt een overzicht gegeven van bekende modulatoren die het circadiane ritme beïnvloeden. Het hoofdstuk begint met een algemene introductie van het circadiane ritme en hoe dit wordt gereguleerd door de transcriptie-translatie feedbacklussen, evenals de eiwitten die hierin een belangrijke rol spelen. Vervolgens wordt een voorbeeld besproken van wat er kan gebeuren wanneer het ritme niet goed gereguleerd wordt. Daarna wordt ingegaan op de kleine moleculen die zijn ontwikkeld om deze regulatie te

beïnvloeden. Tevens wordt besproken hoe de regulatie van het circadiane ritme verder kan worden ontrafeld. Dit hoofdstuk biedt daarmee de context voor het vervolg van het proefschrift. In Hoofdstuk 2 wordt de ontwikkeling van een fotoaffiniteitsprobe gebaseerd op CEM3 beschreven, met als doel te achterhalen via welk eiwit CEM3 zijn amplitude verhogende effect uitoefent. De probe werd in levende cellen gevalideerd op zijn vermogen om het circadiane ritme op vergelijkbare wijze als CEM3 te moduleren en werd vervolgens toegepast in cellysaten om moleculaire targets te identificeren. Met deze aanpak werd het redox regulerende enzym NADHcytochroom b5 reductase 3 (CYB5R3) geïdentificeerd als target van CEM3. Remming van de reductaseactiviteit van CYB5R3 door CEM3 leidde tot een toename van de amplitude van het circadiane ritme in zowel muisfibroblasten als suprachiasmatische nucleus (SCN)-plakken. Dit nieuwe target voor amplitude verhoging kan in de toekomst worden gebruikt als startpunt voor de ontwikkeling van nieuwe modulatoren. Hoofdstuk 3 beschrijft het ontwerp, de synthese en evaluatie van affiniteitsgebaseerde probes voor de MT2-receptor. Twee scaffolds voor de MT2 receptor zijn gedockt in de bindingspocket. Op basis van de nabijheid van de scaffolds tot een potentieel ankerpunt voor covalente binding zijn er verschillende potentiële covalente liganden ontworpen en gesynthetiseerd. Deze werden eerst geëvalueerd in radioligandbindingsassays om hun affiniteit ten opzichte van de MT2-receptor te bepalen, gevolgd door beoordeling van covalente binding via tijdsafhankelijke bindingsexperimenten. Er werd geen tijdsafhankelijk effect waargenomen, wat mogelijk te wijten is aan beperkingen in de duur van de assay. Potente liganden werden vervolgens voorzien van een alkyn-handvat om visualisatie van de receptor mogelijk te maken. Het labelen van de receptor werd onderzocht met behulp van SDS-PAGE-experimenten, waarbij labeling van membraaneiwitten werd waargenomen voor één van de probes. Deze probes kunnen mogelijk in de toekomst worden gebruikt om de lokalisatie van de MT2 receptor beter in kaart te brengen. In Hoofdstuk 4 wordt de structuur-activiteitsrelatie (SAR) van CEM3-afgeleide CYB5R3-remmers onderzocht om inzicht te krijgen in de moleculaire interacties die ten grondslag liggen aan remming. Modificaties van de CEM3-structuur toonden het belang aan van de tricyclische kern, de secundaire amine en de aromatische groep voor remmende activiteit. Onder de geëvalueerde derivaten bleek verbinding 24 de meest potente remmer, wat een basis vormt voor verdere optimalisatie. Moleculaire dockingstudies werden uitgevoerd om de mogelijke bindingsmodus van CEM3 en verbinding 24 te onderzoeken. De voorspelde posities konden de waargenomen SAR-trends echter niet volledig verklaren. In lijn hiermee leidden structuurgeleide modificaties op basis van het dockingsmodel niet tot verdere verbeteringen in affiniteit. Dit suggereert dat de voorspelde bindingsplaats mogelijk niet overeenkomt met de werkelijke bindingsplaats van deze stoffen. Toekomstige analyses zouden zich daarom moeten richten op het identificeren en evalueren van andere potentiële pockets binnen CYB5R3 met behulp van computationele benaderingen zoals docking en moleculaire dynamica, in combinatie met experimentele validatie via sitedirected mutagenese om hun rol in CEM3-binding te bepalen. Hoofdstuk 5 geeft een samenvatting van de belangrijkste bevindingen van dit proefschrift en bespreekt mogelijke richtingen voor toekomstig onderzoek. De ontwikkelde fotoaffiniteitsprobe voor CEM3 heeft bijgedragen aan een beter inzicht in de eiwitten die betrokken zijn bij de door CEM3 geïnduceerde verhoging van de amplitude. Door het moleculaire target dat werd geïdentificeerd te gebruiken als startpunt voor een SAR-studie, werd de activiteit van CEM3 verder verbeterd. Daarnaast werd een potentiële affiniteitsgebaseerde probe voor de MT2-receptor ontwikkeld, die in toekomstige studies kan worden gebruikt om de lokalisatie van de receptor te onderzoeken. Gezamenlijk tonen deze resultaten het nut aan van chemisch-biologische benaderingen bij het ontrafelen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de regulatie van het circadiane ritme. Uiteindelijk benadrukt dit proefschrift het potentieel van kleine moleculen als hulpmiddelen voor zowel mechanistische studies als therapeutische modulatie van de circadiane ritme.